NK 細胞培養標準操作方案

(1L 體系版本)

為了能獲得穩定可靠的結果，請嚴格按照以下所述步驟進行操作，并使用我們推薦的實驗耗材及試劑。本試劑盒包含四種刺激組分(NK Cell Grower1~4)，每管體積為500 μl，建議每管組分拿出靜置后再加入到培養基中，并用培養基潤洗管子，以確保每管所有組分都能加入到培養基中。請認真閱讀說明書配置每種擴增液！

【實驗材料】

NK Cell Culture Medium(1000 ml)

NK Cell Grower 1(500 μl) NK Cell Grower 2(500 μl) NK Cell Grower 3(500 μl) NK Cell Grower 4(500 μl)

懸浮細胞專用細胞培養瓶(T25、T75、T175)(透氣蓋培養瓶，推薦康寧品牌) 懸浮細胞專用培養袋

淋巴細胞分離液

無菌生理鹽水或PBS

【實驗操作方案】

* 所有的工作必須在無菌室中進行，請嚴格遵守無菌操作規范，使用無菌耗材。

1、培養瓶包被

(1) 在T-25 cm2 懸浮培養瓶中，加入3.5 ml PBS 和500 μl NK Cell Grower 1；

(2) 輕輕搖晃，使溶液在培養瓶瓶底擴散，鋪滿瓶底；

(3) 37℃培養箱靜置2 h 或在4℃靜置過夜；

(4) 移除包被溶液，用 5 ml PBS 潤洗瓶底 1 次(請勿吹打瓶底)，洗過的培養瓶要立即使用。

2、血液分離

（1） 采集 20 ml 外周血于抗凝管(務必用肝素抗凝管)，800g，15 min 室溫離心；

（2） 自體血漿制備：取上清血漿，置于水浴鍋中 56℃，滅活 30 min 后 1100g，15 min 室溫離心，用移液管將上清轉移至新的 15 ml 管內，4℃保存備用；

（3） 取上述離心后下部細胞成分，加 PBS 至 20 ml，混勻，加到 2 個裝有 10 ml 醫療級人淋巴細胞分離液的 50 ml 離心管中，室溫下， 500g 離心 30 min，慢升慢降(加速度 2，減速度 0)；

（4） 離心后，血液被分為 4 層，由血漿(上層)、血漿和分離液之間的單個核細胞(第 2

層)、分離液(第 3 層)和紅細胞層(底層)構成。

3、制備PBMC

（1） 用吸管將第 2 層單個核細胞收集至新的離心管；

（2） 加入 40 ml PBS 洗滌細胞懸液，300g 離心 8 min；

（3） 棄去上清液，再加入 40 ml PBS 洗滌細胞懸液，300g 離心 8 min。

（4） 棄去上清液，加入 20 ml NK Cell Culture Medium 稀釋細胞懸液，混勻，取 100 μl 懸液細胞計數，余下懸液 300g 離心 8 min。

注：整套試劑可激活2-2.5*107PBMC，多余細胞可以棄去。

4、NK 細胞擴增

(1) Day0，配置NK細胞擴增液A：將全部的NK Cell Grower 2(500 μl)加入到10 ml NK Cell Culture Medium 中，加入1 ml滅活后的自體血漿。用該擴增液重懸將上述細胞到2~2.5*106/ml(該套試劑盒中只能配置10 ml擴增液A，即重懸2~2.5*107 細胞，因此多余細胞在上述計數后可以棄去)；

（2） 在已包被的T25培養瓶中，加入以上細胞懸浮液(以8 ml最合適，即起始細胞總數為1.6~2*107)，請沿培養瓶側壁加入細胞，動作需輕柔，請勿直接吹打培養瓶底；

(3）5% CO2、37℃培養3 天(在此期間請勿移動細胞，整個培養以靜置為主)；

(4) Day3，配置NK細胞擴增液B：將全部的NK Cell Grower 3(500 μl)加入到130 ml NK Cell Culture Medium 中。用移液管輕輕吹打T25培養瓶中的細胞，將細胞懸液全部轉入T75培養瓶內，加入15 ml NK細胞擴增液B(剩余擴增液B放2-8℃保存)， 同時補加1.5 ml滅活后的自體血漿；